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發(fā)現(xiàn)

在轉基因的矮牽牛花中所觀察到的RNA干擾現(xiàn)象

RNA干擾現(xiàn)象是1990年由約根森（Jorgensen）研究小組在研究查爾酮合成酶對花青素合成速度的影響時所發(fā)現(xiàn)，為得到顏色更深的矮牽牛花而過量表達查爾酮合成酶，結果意外得到了白色和白紫雜色的矮牽牛花，并且過量表達查爾酮合成酶的矮牽?；ㄖ胁闋柾铣擅傅臐舛缺日０珷颗；ㄖ械臐舛鹊?0倍。約根森推測外源轉入的編碼查爾酮合成酶的基因同時抑制了花中內源查爾酮合成酶基因的表達 。

1992年，羅馬諾（Romano）和Macino也在粗糙鏈孢霉中發(fā)現(xiàn)了外源導入基因可以抑制具有同源序列的內源基因的表達 。1995年，Guo和Kemphues在線蟲中也發(fā)現(xiàn)了RNA干擾現(xiàn)象 。

1998年，安德魯·法厄（Andrew Z. Fire）等在秀麗隱桿線蟲（C.elegans）中進行反義RNA抑制實驗時發(fā)現(xiàn)，作為對照加入的雙鏈RNA相比正義或反義RNA顯示出了更強的抑制效果 。從與靶mRNA的分子量比考慮，加入的雙鏈RNA的抑制效果要強于理論上1:1配對時的抑制效果，因此推測在雙鏈RNA引導的抑制過程中存在某種擴增效應并且有某種酶活性參與其中。并且將這種現(xiàn)象命名為RNA干擾。

2006年，安德魯·法厄與克雷格·梅洛（Craig C. Mello）由于在RNAi機制研究中的貢獻獲得諾貝爾生理及醫(yī)學獎。

機制

siRNA

RNA干擾現(xiàn)象的機理

RNA干擾作用是通過一類較穩(wěn)定的中間介質實現(xiàn)的。對植物的研究證明，雙鏈RNA復合體先降解成為35nt左右的小RNA分子，然后他們通過序列互補與mRNA結合，從而導致mRNA降解 。對果蠅的研究證明，長度為21～23nt的小RNA分子是引起RNA干擾現(xiàn)象的直接原因 。這種小RNA分子被稱之為小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）。

在RNA干擾中一個非常重要的酶是RNaseIII核酶家族的Dicer。它可與雙鏈RNA結合，并將其剪切成21～23nt及3"端突出的小分子RNA片段，即siRNA。隨后siRNA與若干個蛋白組成的，RNA引起的稱之為RNA誘導沉默復合體（RNA-induced silencing complex，簡稱RISC）結合，解旋成單鏈，并由該復合體主導RNAi效應 。RISC被活化后，活化型RISC受已成單鏈的siRNA引導（guide strand），序列特異性地結合在標靶mRNA上并切斷標靶mRNA，引發(fā)靶mRNA的特異性分解。

迄今為止已鑒定出包括Dicer在內的若干個與RNAi有關的蛋白因子。在果蠅（Drosophila melanogaster）RISC中，已知存在著稱為Argonaute2（AGO2）的因子，AGO2蛋白的表達受到抑制時，RNAi效應缺失，也就是說AGO2是果蠅RNAi機制的必須因子。研究表明Argonaute家族蛋白具有RNA切割酶活性（slicer activity），RNAi機制正是由Argonaute家族蛋白的RNA切割酶活性主導。另外，幾個RNA解旋酶（RNA helicase）也被鑒定為參與RNAi機制的因子。在秀麗隱桿線蟲（C. elegans）的RNAi中必須的因子有EGO1，這是一種RdRP（RNA-dependent RNA Polymerase），植物中也存在該蛋白同系物。RNAi中RdRP是將標靶mRNA作為模板，以導入的dsRNA（或siRNA）作為引物合成RNA，在細胞內針對于標靶mRNA合成新siRNA的酶。這一反應在一些生物的RNAi中為必須，但RdRP活性在人和果蠅的RNAi中是非必須的，這說明在不同物種之間RNAi機制的基本框架雖然相同，但存在著微妙差異。

microRNA

在真核生物當中，還存在另外一種小分子RNA（microRNA）也能引起RNA干擾現(xiàn)象。microRNA大多20-22nt長，前體具有類似發(fā)夾性的莖環(huán)結構。microRNA產生于該莖環(huán)結構的雙鏈區(qū)。其特點與siRNA基本上相同 。

RNA干擾的作用

2001年，Tuschl等將siRNA導入到哺乳動物細胞中并由此解決了在哺乳細胞內導入長的雙鏈RNA時引發(fā)的干擾素效應，由此拓展了RNAi在基因治療上應用前景。RNAi機制普遍存在于動植物，尤其是低等生物中 。因此被認為是進化上相對保守的基因表達調控機制。一種假說為 ，RNAi機制是作為在RNA水平上抵御病毒入侵的防御機制而存在的。在病毒自身基因組所包含的，或在病毒復制過程中產生的雙鏈RNA可以被Dicer識別，從而引起病毒RNA降解。但是許多病毒為抵抗宿主的RNA干擾機制，會產生抑制宿主RNA干擾的蛋白，以保護病毒基因在宿主體內的順利復制。已經發(fā)現(xiàn)的可以抑制宿主RNA干擾的病毒蛋白有potyviruses編碼的HC-PRO蛋白、馬鈴薯X病毒編碼的Cmv2b蛋白、獸棚病毒編碼的B2蛋白等 。

RNA干擾也是抑制破壞基因結構的一種DNA片段轉錄子活性的重要方式。轉錄子通常以逆轉錄的方式在基因組中擴增。在逆轉錄過程中產生的雙鏈RNA分子可以被Dicer識別，從而被降解 。

目前發(fā)現(xiàn)，RNAi機制中的相關一些因子如內源性雙鏈RNA及蛋白因子可以在多種層次上對基因表達進行調控，其范圍已經超越了PTGS（post transcriptional gene silencing），如RNAi機制同樣參與了轉錄水平上的基因表達調控過程中。

應用

RNAi在 基因沉默 （ 英語 ： silent gene ） （silent gene）方面具有高效性和簡單性，所以是基因功能研究的重要工具。

大多數(shù)藥物屬于標靶基因（或疾病基因）的抑制劑，因此RNAi模擬了藥物的作用，這功能丟失（LOF)的研究方法比傳統(tǒng)的功能獲得（GOF)方法更具優(yōu)勢。因此, RNAi在今天的制藥產業(yè)中是藥物靶標確認的一個重要工具。同時，那些在靶標實驗中證明有效的siRNA/shRNA本身還可以被進一步開發(fā)成為RNAi藥物。

在藥物標靶發(fā)現(xiàn)和確認方面，RNAi技術已獲得了廣泛的應用。生物技術公司或制藥公司通常利用建立好的RNAi文庫來引入細胞，然后通過觀察細胞的表型變化來發(fā)現(xiàn)具有功能的基因。如可通過RNAi文庫介導的腫瘤細胞生長來發(fā)現(xiàn)能抑制腫瘤的基因。一旦所發(fā)現(xiàn)的基因屬于可用藥的靶標（如表達的蛋白在細胞膜上或被分泌出細胞外），就可以針對此靶標進行大規(guī)模的藥物篩選。此外，被發(fā)現(xiàn)的靶標還可用RNAi技術在細胞水平或動物體內進一步確認。

在疾病治療方面，雙鏈小分子RNA或siRNA已被用于臨床測試用于幾種疾病治療，如老年視黃斑退化、肌肉萎縮性側索硬化癥、類風濕性關節(jié)炎、肥胖癥等。在抗病毒治療方面，帕金森病等神經系統(tǒng)疾病已經開始初步采用RNA干擾療法。腫瘤治療方面也已經取得了一些成果 。

參考文獻

來源

Recent develpment of RNAi in drug target discovery and validation, Drug Disvoery Today: Technologies .(2006)3:293-300.

Development of new RNAi therapeutics, Histology and Histopathology . (2007)22:211-217.

《新藥藥物靶標開發(fā)技術》，2006年版，高等教育出版社，ISBN 7-04-018953-4

參見

小干擾RNA（siRNA）

小發(fā)夾RNA（shRNA）

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