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歷史

最早的PCR機器Baby Blue 1986Thermocycler

能協(xié)同操作的兩組式機器

8塊加熱板的循環(huán)機型

聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)是由凱利·穆利斯發(fā)明，因此在7年之后的1993年10月，獲得了諾貝爾化學(xué)獎。穆利斯的想法是，利用一種人工方法，和反復(fù)相同程序的方法，并利用一種特殊的酶——即DNA聚合酶來擴增特定的DNA片段。

DNA聚合酶天然存在于生物體內(nèi)，在細胞分裂前進行DNA的復(fù)制。當DNA開始復(fù)制時，解旋酶將雙股的DNA分開成兩個單股。DNA聚合酶便結(jié)合在兩DNA單股鏈上，生成互補鏈。在穆利斯最初的聚合酶鏈式反應(yīng)中，將DNA聚合酶用于體外試驗。但是，沒有采用正常細胞常溫解旋的方法，而是把雙鏈DNA加熱到96℃，使得雙鏈分離成為兩條單鏈。但是在這個溫度下，DNA聚合酶被破壞，因此在每個循環(huán)的加熱步驟后必須補充新的聚合酶。穆利斯的原始聚合酶鏈式反應(yīng)效率極低，需要大量時間和DNA聚合酶，并且在整個聚合酶鏈式反應(yīng)中都需要人來照看。

后來，由嗜熱細菌水生棲熱菌（ Thermus aquaticus ）體內(nèi)產(chǎn)生的DNA聚合酶改善了這種低效的聚合酶鏈式反應(yīng)。由于嗜熱細菌生活在溫度達到50至80 °C（122至176 °F）的間歇泉中，它的DNA聚合酶具有耐熱性。在用于聚合酶鏈式反應(yīng)時，高溫并不能破壞這種DNA聚合酶，因此不需要不斷加入新的聚合酶，聚合酶鏈式反應(yīng)由此變得簡單并且可以由機器操作。

  熱循環(huán)機

最初的具有耐熱性的DNA聚合酶來自于水生棲熱菌（ Thermus aquaticus ），是1976年臺籍科學(xué)家錢嘉韻（Alice Chien）從黃石國家公園發(fā)現(xiàn)的，因此被稱為 Taq 。 Taq 酶被廣泛用于當前的聚合酶鏈式反應(yīng)操作中， Taq 酶的缺點是它缺少3"->5"校正外切酶活性，因此在復(fù)制DNA時有時會出錯，造成DNA序列突變（錯誤）。但是又是從古菌中獲得的 Pwo 酶及 Pfu 酶，發(fā)現(xiàn)均有校正機制，能夠大大降低聚合酶鏈式反應(yīng)中的突變。將 Taq 與 Pfu 結(jié)合使用可以保證真實準確的能夠擴增DNA。

專利之爭

聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)的專利由Cetus公司持有，穆利斯發(fā)明聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)的時候在那個公司工作。Taq聚合酶也受專利保護。關(guān)于這個技術(shù)有幾個訴訟案，包括著名的杜邦訴訟案。制藥公司Hoffmann-La Roche于1992年買下了專利并持有至今。

在世界各地的多個司法管轄區(qū)，羅氏與Promega公司與Taq聚合酶相關(guān)的專利爭斗仍然在繼續(xù)。法律上的爭論已經(jīng)超出了聚合酶鏈式反應(yīng)和Taq聚合酶專利的期限，這些專利已于2005年3月28日到期。

操作過程

聚合酶鏈式反應(yīng)用于擴增一小段已知的DNA片段，可能是單個基因，或者僅僅是某個基因的一部分。與活體生物不同的是，PCR只能復(fù)制很短的DNA片段，通常不超過10kbp。DNA是雙鏈分子，因此用互補DNA雙鏈的構(gòu)造單位（核苷酸）來度量其大小，單位為堿基對（base pair, bp）。某些特定的方法可以擴增40kbp左右的片斷，但是這種大小與真核細胞的染色體DNA相比仍然是很少的。例如，人的體細胞DNA含有大約30億個堿基對。 目前應(yīng)用的聚合酶鏈式反應(yīng)需要幾個基本組成：

DNA模板（template），含有需要擴增的DNA片斷。

2個引物（primer），決定了需要擴增的起始和終止位置。（見下面引物一節(jié)）

DNA聚合酶（polymerase），復(fù)制需要擴增的區(qū)域。

脫氧核苷三磷酸（dNTP），用于構(gòu)造新的互補鏈。

緩沖體系，提供適合聚合酶行使功能的化學(xué)環(huán)境。

聚合酶鏈式反應(yīng)在熱循環(huán)設(shè)備中進行。PCR儀可以將反應(yīng)管加熱或冷卻到每步反應(yīng)所需的精確的溫度。為防止反應(yīng)體系中液體產(chǎn)生蒸氣，通常在反應(yīng)管上加蓋加熱的蓋子（比加熱板溫度來的高），或者在反應(yīng)體系表面加入一層石蠟油。

引物

特定的專一性引物決定了所擴增的DNA片斷。而引物（primer）本質(zhì)上是人工合成的短DNA片斷，一般不超過50個堿基（通常18－25個），它們與所要擴增的DNA片斷的起始和終止區(qū)域完全互補。在“黏合”時引物結(jié)合于DNA模板的起始和終止點，DNA聚合酶結(jié)合到這兩個位置，開始合成新的DNA鏈。

選擇引物的長度和熔點（T m ）要考慮許多條件。引物的熔點與聚合酶鏈式反應(yīng)第一步中DNA的熔點不同，是指50％的引物與模板結(jié)合的溫度，高于這個溫度引物與模板就不能有效結(jié)合。這個溫度隨著引物長度的增加而升高。如果引物長度太短，就有可能與DNA模板的幾個位置結(jié)合，造成非特異性復(fù)制。另一方面，引物長度也受限于T m 。如果T m 太高，即高于80℃，也會導(dǎo)致問題，因為DNA聚合酶在此溫度下活性較低。引物最優(yōu)長度通常為20到40個堿基，熔點從60℃到75℃。

有時也用到簡并引物，是一些相似但不相同的的引物的混合物。通常用于從不同的生物DNA中擴增相同的基因，因為這些基因通常都是近似但不相同的。應(yīng)用兼并引物的另一種情況是根據(jù)蛋白質(zhì)序列設(shè)計引物時，由于幾個不同的密碼子都能編碼一個氨基酸，通常難以判斷在DNA中究竟是哪個密碼子編碼的這個氨基酸。例如編碼異亮氨酸的引物可能使用"ATH"，A是腺嘌呤，T是胸腺嘧啶，H可能是腺嘌呤，胸腺嘧啶或者胞嘧啶（關(guān)于堿基如何編碼蛋白質(zhì)，可查看遺傳密碼）。使用簡并引物在很大程度上降低了聚合酶鏈式反應(yīng)擴增等特異性，這個問題可以使用遞減PCR（touchdown PCR）部分地解決。

基于上述考慮，設(shè)計引物可以采取以下原則：

GC所占比例為40％－60％

計算兩個引物的T m （T m 值=4(G+C) +2(A+T)），使之不相差5℃，并且擴增產(chǎn)物的T m 與引物的相差不超過10℃。

黏合溫度通常比計算的最低T m 低5℃，但是要根據(jù)經(jīng)驗為不同條件下的聚合酶鏈式反應(yīng)選擇不同的黏合溫度。

內(nèi)部的具有自身互補性的發(fā)夾結(jié)構(gòu)不超過4個，其二聚體中不超過8個。

3"末端尤其重要，必須不含有與其他引物互補的序列，并且要與模板完全互補。

現(xiàn)有一些幫助設(shè)計引物的程序（見外部鏈接）。

步驟

一般的聚合酶鏈式反應(yīng)由20到35個循環(huán)組成，每個循環(huán)包括以下3個步驟：

變性 ：利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個循環(huán)之前，通常加熱長一些時間以確保模板和引物完全分離，僅以單鏈形式存在。該步驟時間1-2分鐘，接下來機器就控制溫度進入循環(huán)階段。

退火 或稱 接合 ：在DNA雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引子熔點5℃。錯誤的退火溫度可能導(dǎo)致引物不與模板結(jié)合或者錯誤地結(jié)合。該步驟時間1-2分鐘。新技術(shù)的融合型核酸聚合酶在此階段的溫度會高于熔點3~5℃，僅需時間5~10秒。

延伸 ：DNA聚合酶由降溫時結(jié)合上的引子開始沿著DNA鏈合成互補鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片斷長度。傳統(tǒng)的Taq估計合成1000bp大概需要1分鐘、較新的Tbr（來自于嗜熱菌Thermus brockianus ）約40秒、融合型聚合酶僅約15秒。

聚合酶鏈鎖反應(yīng)簡圖 (1) 96℃高溫下使雙股DNA打開 (2)在約68℃下讓引子與DNA配對 (3)在72℃ DNA延伸 (P=聚合酶). (4)第一循環(huán)完成，做出的兩段雙股DNA又可當作下一個循環(huán)模板，這樣每次循環(huán)都使得擴增的DNA片段加倍。

實例

優(yōu)化聚合酶鏈式反應(yīng)

在實踐中，聚合酶鏈式反應(yīng)可以因各種原因而失敗，部分原因是由于其對于污染的敏感性，導(dǎo)致擴增錯誤的DNA產(chǎn)物。正因為如此，人們已經(jīng)開發(fā)了一些技術(shù)和步驟來優(yōu)化聚合酶鏈式反應(yīng)條件。將聚合酶鏈式反應(yīng)前的混合物與潛在DNA污染物分開的實驗室方案和流程解決了外源DNA的污染問題。這通常包括從用于分析的區(qū)域分理出聚合酶鏈式反應(yīng)的設(shè)定區(qū)域或者說聚合酶鏈式反應(yīng)產(chǎn)物的純化，一次性塑料制品的使用，及對反應(yīng)裝置之間的工作臺面徹底清潔。引物的設(shè)計技術(shù)在改善聚合酶鏈式反應(yīng)產(chǎn)物產(chǎn)率和避免雜產(chǎn)物的形成是很重要的。替代緩沖成分和聚合酶的使用有助于較長或存在其他問題的DNA區(qū)域的擴增。在緩沖體系中加入試劑，如甲酰胺，或會增加聚合酶鏈式反應(yīng)的特異性和產(chǎn)量?？梢岳糜嬎銠C模擬理論聚合酶鏈式反應(yīng)結(jié)果（電子聚合酶鏈式反應(yīng)），以協(xié)助在引物設(shè)計。

最新進展

各種變體

遞減PCR（touchdown PCR）：前幾循環(huán)溫度逐漸下降。

逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）：以由mRNA逆轉(zhuǎn)錄而來的DNA為模板，由此產(chǎn)生出來的DNA不帶有內(nèi)含子（基因中不具意義的段落），常應(yīng)用于分子克隆技術(shù)。

熱啟動PCR（hot start PCR）：以高熱激活型核酸聚合酶進行反應(yīng)，減少非專一性產(chǎn)物。

即時PCR（real-time PCR）：PCR過程中利用螢光探針或染料定量檢測，又稱定量PCR（quantitative PCR）。

巢式PCR（nested PCR）：先用低特異性引物擴增幾個循環(huán)以增加模板數(shù)量，再用高特異性引物擴增。

多重PCR（multiplex PCR）：在同一個管中使用多組引物。

復(fù)原條件PCR（reconditioning PCR）：PCR產(chǎn)物稀釋10倍后重新放入原濃度的引物和dNTP等循環(huán)3次，以消除產(chǎn)物中的異二聚體。

dsRNA合成（dsRNA replicator）：合并使用high-fidelity DNA polymersae、T7RNA聚合酶與Phi6 RNA replicase；從雙股DNA轉(zhuǎn)錄為對應(yīng)的雙股RNA（dsRNA）?？蓱?yīng)用于RNAi實驗操作。

COLD-PCR( co -amplification at l ower d enaturation temperature-PCR):用以檢測突變或特殊等位基因的PCR應(yīng)用技術(shù)。

Digital-PCR：將標準的PCR反應(yīng)分割至每一個反應(yīng)中僅1~2個copy。藉以偵測微小比例的基因差異。應(yīng)用于：癌癥突變基因、病原體檢測、借由母血對胎兒做產(chǎn)前檢測。

應(yīng)用

基因圖譜建立

親子鑒定

偵測遺傳疾病

復(fù)制特定基因

基因突變研究

DNA遺傳演化

基因表達比較

鑒定基因

人體內(nèi)的細胞共有有約為30億個堿基對的DNA，每個人的DNA會有差異，具有差異的堿基對數(shù)目達幾百萬之多，因此通過分子生物學(xué)方法顯示的DNA圖譜也因人而異，由此可以識別不同的人。所謂“DNA指紋”，就是把DNA作為像指紋那樣的獨特特征來識別不同的人。由于DNA是遺傳物質(zhì)，因此通過對DNA鑒定還可以判斷兩個人之間的親緣關(guān)系。

親子鑒定

診斷遺傳病

聚合酶鏈式反應(yīng)允許白血病、淋巴瘤等惡性疾病的早早期診斷。此法是當今癌癥研究中最發(fā)達的，并已被常規(guī)使用。聚合酶鏈式反應(yīng)分析能以高于其他細胞10,000倍的敏感度在核酸DNA樣本中直接探測具特定轉(zhuǎn)錄的惡性細胞。

聚合酶鏈式反應(yīng)同樣可以對不可培養(yǎng)的或生長緩慢的微生物（如分支桿菌、厭氧細菌、組培分析和動物模型中的病毒）進行定位。在微生物學(xué)中，聚合酶鏈式反應(yīng)診斷性應(yīng)用的基礎(chǔ)是傳染媒介的探測和從病原種系中借助特定基因的分離出非致病的種系。

復(fù)制特定基因

誘變

分析遠古DNA

鑒定特定表型的突變體基因

比較基因表達量

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