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　　井伊直虎是遠(yuǎn)江井伊谷城主(國(guó)人)井伊直盛的女兒，母為新野親矩之妹祐椿尼。幼名不明，出生年份不明，推測(cè)天文5年(1536年)前后誕生。

　　早年出家

　　天文11年(1542年)，井伊直虎的祖父井伊直宗因?yàn)榻翊x元的命令參與三河國(guó)田原城的攻城戰(zhàn)而戰(zhàn)死。父親井伊直盛因?yàn)闆]有兒子，打算將其堂弟井伊直親(直盛的叔父井伊直滿的兒子)作為自己的婿養(yǎng)子。

　　天文13年(1544年)，因?yàn)榫潦系募依闲∫暗栏?政直)的讒言，井伊直親的父親井伊直滿及其弟弟井伊直義被懷疑要向今川義元謀反而被迫自殺，直親也因此逃亡到信濃國(guó)。在井伊直親逃亡期間，井伊直虎(此前幼名不明)出家為尼，取名為次郎法師。

　　弘治元年(1555年)，井伊直親在道高死后一年才回到今川家，但在信濃的期間，娶了奧山親朝(另一說(shuō)是奧山朝利)之女為正室，因此只能解除與次郎法師的婚約。

　　永祿3年(1560年)5月，井伊直盛在桶狹間之戰(zhàn)中戰(zhàn)死。

　　永祿5年(1562年)，井伊直親繼承家督，但又因?yàn)樾∫暗篮?道高之子)讒言被今川氏真賜死。井伊一族曾因此受到連累，在舅父新野親矩(次郎法師母親祐椿尼的兄長(zhǎng))的擁護(hù)下而獲救。

　　永祿6年(1563年)，曾祖父井伊直平在進(jìn)攻天野氏的犬居城的途中去世。依據(jù)《井伊直平公御一代記》的記載(詳見井伊家傳記)，是因?yàn)楹攘艘否R城(1570年德川家康入城后改名為濱松城)城主飯尾連龍妻子田鶴方(椿姬)的毒茶而死亡(遠(yuǎn)州惣劇)。

　　永祿7年(1564年)，因今川氏聲勢(shì)衰退不止，引發(fā)飯尾連龍等人叛亂，新野親矩及直盛的重臣中野直由代表今川一方討伐曳馬城(引間城)而被殺死。身為龍?zhí)端伦〕值氖甯改舷鹇劔@悉后，將直親的幼子虎松(后來(lái)的井伊直政)移送到鳳來(lái)寺。

　　繼任家主

　　永祿8年(1565年)，由于家中沒有男丁，次郎法師還俗，并以井伊直虎的男兒之名繼承井伊家督之位。

　　永祿11年(1568年)，小野道好進(jìn)攻井伊谷城。同年，由于小野專橫，井伊谷三人眾(近藤康用、鈴木重時(shí)、菅沼忠久)尋求德川家康幫助。12月15日德川家康遠(yuǎn)州侵攻，在家康協(xié)助下井伊直虎得回實(shí)權(quán)，小野道好開始逃亡。然后井伊氏為了復(fù)仇而攻入引間城(在丈夫死后，成為城主的田鶴方因此自殺)。

　　元龜元年(1570年)，德川家康追究小野道好陷害直親之事，處死被捕的小野道好。

　　元龜3年(1572年)秋，武田信玄部將山縣昌景攻略井伊谷城，井伊直虎在井平城防衛(wèi)戰(zhàn)敗退后逃亡浜松城。之后濱松城的織田·德川聯(lián)合軍在三方原合戰(zhàn)及隔年的野田城之戰(zhàn)遭到武田軍的潰敗。

　　元龜4年(1573年)4月，武田信玄病倒，武田軍撤退，井伊直虎奪回井伊谷城。

　　在井伊直虎擔(dān)任城主的期間(1565年起)，收直親的遺兒虎松(井伊直政)為養(yǎng)子。

　　天正3年(1575年)，15歲的井伊直政以三百石出仕德川氏。

　　天正10年8月26日(1582年9月12日)井伊直虎病逝，家督由21歲的井伊直政繼承。葬于井伊家的龍?zhí)端拢c直親合墓。